Какова последовательность этапов получения рекомбинантной плазмиды?

Вот базовая, рабочая схема получения рекомбинантной плазмиды (из опыта «мокрой» молекулярки). Этапы идут в порядке выполнения — от идеи до подтверждения клона:

1. Выбор и подготовка вектора
   • Подбирают плазмиду с нужными элементами: репликон (ori), маркер устойчивости к антибиотику, MCS (полилинкер), промотор/терминатор — если планируется экспрессия.
   • При необходимости вектор линеаризуют подходящими рестриктазами, очищают из геля. Часто добавляют шаг дефосфорилирования (CIP/TSAP), чтобы снизить самозамыкание.

2. Получение «вставки» (таргетного фрагмента ДНК)
   • Источник — ПЦР-амплификат, кДНК, геномная ДНК или синтетический ген.
   • Если нужна клонирование через рестрикционные сайты — их закладывают в праймеры (с защитными «хвостами»), амплифицируют, режут теми же ферментами, что и вектор, и очищают.
   • Для TA-клонирования — оставляют A-хвосты на ПЦР-продукте. Для безферментных методов (Gibson/SLiCE/In-Fusion) — добавляют праймерами 15–40-нуклеотидные перекрытия к краям вставки.

3. Сшивка вставки с вектором
   Вариант A. Рестрикционно-лигазное клонирование
   • Смешивают совместимые концы вектора и вставки (часто в молярном соотношении 1:3), проводят лигирование T4 ДНК-лигазой.

Вариант B. «Бесшовные» сборки
• Gibson Assembly / In-Fusion / SLiCE: за счёт перекрывающихся концов и активности экзонуклеазы/полимеразы/лигазы получают цельную плазмиду без «шрамов» рестрикции.

Вариант C. TA-клонирование
• Лигирование A-хвостатого ПЦР-продукта в T-вектор.

4. Трансформация компетентных клеток
   • Химически компетентные (CaCl₂, heat-shock) или электрокомпетентные клетки E. coli.
   • После восстановления высеивают на селективные чашки с соответствующим антибиотиком; при наличии синего/белого скрининга — добавляют X-gal/IPTG.

5. Первичный отбор клонов
   • Считают колонии, выбирают «правильные» по маркеру и, при blue-white, по белому фенотипу.
   • Скрининг экспресс-методами: колонийный ПЦР (праймеры к вставке/к вектору), быстрая мини-подготовка и рестрикционный анализ. Иногда — скрининг по размерам ПЦР-продукта с фланк-праймерами M13/универсальными.

6. Минипреп и аналитическая проверка
   • Делают мини-преп плазмиды из 3–10 позитивных клонов.
   • Подтверждают:
   – Рестрикционный анализ (ожидаемые полосы).
   – ПЦР с проверочными праймерами.
   – Обязательно Sanger-секвенирование через вставку и стыки (junctions) — чтобы убедиться в правильной последовательности/рамке считывания и отсутствии мутаций.

7. (Опционально) Перенос в экспрессионный штамм и масштабирующий преп
   • При необходимости — ретрансформация подтверждённого плазмидного клона в экспрессионный штамм, средний/макси-преп для дальнейшей работы.

Короткая «схема в одну строку»:
Выбор вектора → подготовка вставки → создание совместимых концов → лигирование/сборка → трансформация → селекция → скрининг (колонийный ПЦР/рестрикция) → минипреп → секвенирование подтверждённого клона.